ELISA技術(shù)要點與常見問題分析解答
ELISA技術(shù)要點與常見問題分析解答 上海聯(lián)碩生物科技有限公司 在ELISA實驗前的注意事項 1 仔細(xì)閱讀說明書 2 確定試劑盒在有效期內(nèi) 3 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積） 4 標(biāo)本制備要規(guī)范，每份標(biāo)本體積要按2-3個復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無法實驗者，注意低溫保存 5 準(zhǔn)備好所有實驗額外所需物品，如試管、吸頭、移液器、離心機等 6 根據(jù)檢測標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量 7 按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑 DIY夾心法ELISA常見技術(shù)指南 8 選擇抗體時選擇一個單抗和一個多抗進行配對；若選擇兩個單抗，必須識別不同表位的抗體；從同一家公司選擇抗體對。 9 ELISA實驗中為了確定*信號和zui低背景應(yīng)將捕獲抗體（0.5-4μg/ml）和檢測抗體（0.25-2μg/ml）在預(yù)實驗中進行彼此相抗的滴定。同時，應(yīng)包括在適當(dāng)范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋。按試劑說明書常規(guī)提供的范圍進行操作。 10 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：對于每種細(xì)胞因子應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書，注意每批的細(xì)節(jié)。在使用細(xì)胞因子前，瞬時離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細(xì)胞因子。根據(jù)每批說明書中的細(xì)節(jié)，將凍干的細(xì)胞因子復(fù)溶。 11 一般待測抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍的可通過將標(biāo)準(zhǔn)品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml。可利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內(nèi)提高靈敏度。 12 為了優(yōu)化靈敏度，建議過夜孵育標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本。 13 若使用過氧化物酶作為顯色系統(tǒng)，應(yīng)嚴(yán)禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過氧化物酶的活性。 14 當(dāng)測定混合液體中的抗原時，如血清，建議在標(biāo)本稀釋液中加不相干的Ig. ELISA常見問題及處理對策 問題 可能原因 解決方法 無顏色 試劑孵育的時間沒有按說明書操作。 確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時間是否適當(dāng)。 不同試劑盒或不同批號的試劑混用。 重新檢查試劑的標(biāo)簽，確準(zhǔn)所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。 漏加酶 檢查操作流程，注意不要漏加 HRP酶污染了疊氮鈉 使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉 標(biāo)準(zhǔn)品有問題（若在標(biāo)本孔中有信號） 按說明書檢查標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用1瓶新標(biāo)準(zhǔn)品 某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì) 盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠 使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體 重新確認(rèn)所選用的試劑 .漏加顯色劑A或B 加顯色劑后觀察一下液面高度 試劑配制/使用有誤 將實驗重做；嚴(yán)格按說明書操作，每次配制和使用前看清標(biāo)簽。 緩沖液污染 配制新新鮮的緩沖液 顯色弱 超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。 檢查產(chǎn)品的有效期 加入試劑的體積和時間有誤 確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當(dāng)?shù)摹?/span> 試劑、樣品用前未能平衡 用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右 縮短孵育時間能使實驗的信號變?nèi)酢?/span> 檢查孵育的時間。 在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。 確定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。 使用了被污染的試劑 檢查試劑是否被污染。 標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本制備方法不規(guī)范 檢查標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按說明書進行復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的標(biāo)本避免反復(fù)凍融，嚴(yán)禁使用溶血標(biāo)本。樣品用 NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng) 顯色底物制備不規(guī)范 檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當(dāng)充分。 檢測時間不當(dāng) 是否在規(guī)定的時間內(nèi)檢測。 儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。 儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。 高背景（本底） 洗滌操作不規(guī)范 洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應(yīng)*充滿洗滌緩沖液，傾出時應(yīng)迅速。若使用洗板機，應(yīng)校準(zhǔn)并設(shè)定足夠充滿每孔的體積量。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準(zhǔn)確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。 實驗中孵育溫度和時間不適當(dāng) 確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當(dāng) 酶加量過多 加酶前驗看移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確。檢查稀釋度，若必要進行效價測定。 封閉不* 檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。 標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì) 做適當(dāng)?shù)膶φ?/span> 顯色劑受光照時間較長,或污染 顯色劑A和B應(yīng)于使用前10分鐘從冰箱取出 整批樣品放置時間過長,樣品污染 樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染 緩沖液污染 制備新鮮的緩沖液 吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不*而用于加酶或顯色劑 吸頭盡可能一次性使用 太多的信號：全部的板子變成規(guī)則的藍(lán)色 不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結(jié)合的過氧化物酶仍有殘留。 使用洗板機充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準(zhǔn)確。 底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍(lán)色 應(yīng)控制底物混合的時機并立即使用 太多的酶結(jié)合物 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍(lán)色。 使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器 緩沖液中污染金屬或HRP 制備新鮮緩沖液 高CV值（CV：coefficient of variation），花板 操作不慎或洗滌不充分 按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述 出現(xiàn)干板，沒有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用 確定每兩步驟間，酶標(biāo)板應(yīng)保持濕潤。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。 由于操作失誤或板子質(zhì)量差（結(jié)合不均勻）造成包板不均勻。 稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。 檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板） 移液器不準(zhǔn)確，吸頭重復(fù)使用。 檢查并校準(zhǔn)移液器。每次取樣必須換吸頭。回顧標(biāo)本的加入步驟，確保每次加樣的準(zhǔn)確性，保證吸取的液體按所設(shè)定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。 樣品離心處理不全,反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分 標(biāo)本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴(yán)禁使用凝血（溶血）的標(biāo)本 緩沖液污染 制備新鮮的緩沖液 標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到，但兩點之間區(qū)別很差（低或平的曲線） 酶結(jié)合物不足 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 捕獲抗體沒有很好結(jié)合到板上 檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白 檢測抗體不足 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 板子顯色不足 延長底物孵育實驗使用推薦品牌的底物溶液 操作不慎 回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。 標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋度計算有誤 核查計算的情況，制備新的標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產(chǎn)生 在標(biāo)本中無相應(yīng)的細(xì)胞因子 使用內(nèi)參對照重復(fù)實驗，重新考慮實驗的相應(yīng)參數(shù) 標(biāo)本基質(zhì)遮蓋檢測 將標(biāo)本至少做1∶2相應(yīng)的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復(fù)性 標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是標(biāo)本的判讀值很高 標(biāo)本中含的細(xì)胞因子水平超過實驗范圍 將標(biāo)本做稀釋并再次實驗 當(dāng)使用HRP酶結(jié)合物時，TMB底物加終止液后顯綠色 孔中的試劑顯色不充分 輕輕振蕩板子 邊緣效應(yīng) 工作環(huán)境溫度不均衡 避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育 漂移 實驗過程中出現(xiàn)間斷 整個實驗應(yīng)連續(xù)操作：在實驗開始前將所有標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本做適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備 試劑沒有按說明書平衡至室溫 在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。 是否可更改試劑盒 所提供的實驗操作步驟？ 一般廠商為確保zui高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實驗的規(guī)范性應(yīng)按說明書操作。 是否可混用不同試劑盒中的試劑？ 不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商。 是否可增加或減少標(biāo)本的體積。 商品化的試劑盒所需加入的標(biāo)本體積是優(yōu)化的，應(yīng)按說明書操作，不建議更改所加標(biāo)本的體積。 是否可重確定自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線的點？ 可以。說明書上有建議的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線的點，但是必須在實驗范圍內(nèi)，高于試劑盒中zui高標(biāo)準(zhǔn)品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。
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