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ELISA技術(shù)相關(guān)的其他方法

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雙位點一步法

上海聯(lián)碩生物科技有限公司

     在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

     在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

競爭法測抗體

     當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)。抗HBe的檢測一般采用此法。

其方法和特點是：
　　①酶標(biāo)記抗原（抗體）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)體中的非標(biāo)記抗原或抗體具有相同的與固相抗體（抗原）結(jié)合的能力； 　      ②反應(yīng)體系中，固相抗體（抗原）和酶標(biāo)抗原（抗體）是固定*，且前者的結(jié)合位點少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記抗原（抗體）的分子量和；
　　③免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)抗原（抗體）的量（酶活性）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中非標(biāo)記抗原（抗體）的濃度成反比。

ABS-ELISA法
　　ABS為親和素（avidin）生物素（biotin）系統(tǒng)（system）的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個親和素可與4個生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應(yīng)用不多。