尋求反義分子
合理的設(shè)計和特異性使反義分子抓住了人們的想象力。不過，它們比zui初預(yù)測的難生產(chǎn)得多，至今尚無任何證據(jù)表明它們具有去除單一基因的功能，而且，還存在許多未預(yù)測的非反義效應(yīng)。本文旨在綜述反義策略中產(chǎn)生或破壞特異性的一些因素，討論通過不同的標(biāo)準(zhǔn)判斷治療的復(fù)雜性及研究制劑的必要性。
反義分子是指與細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA序列相互補形成雜交體而阻斷或減弱其轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的DNA或RNA片段。目前研究zui多的反義分子主要有反義寡核苷酸（oligo deoxy nucleotides,ODNs）和核酶。科學(xué)家們試圖應(yīng)用這些分子抑制目標(biāo)基因從而了解它們的功能，藥物開發(fā)人員則試圖找到以核苷酸為基礎(chǔ)的治療手段。但是，當(dāng)核酸藥物通過目前尚未了解到的機(jī)制，作用于其它分子，而不是它的靶部位這一“非反義”效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)以后，反義領(lǐng)域被掉轉(zhuǎn)了方向。非反義效應(yīng)并非*有害，實際上，它們所提供的附加療效對藥物工業(yè)來說是大有益處的。不過，它們的不可預(yù)測性使得對核酸試劑的研究變得復(fù)雜起來。
一、設(shè)計合理的反義藥物的障礙
有兩個問題困擾著反義藥物的發(fā)展，一個是核酸藥物通過尚未了解的機(jī)制，作用于其它分子，而不是它的靶部位的“非反義”效應(yīng)；另一個是靶RNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其與細(xì)胞蛋白質(zhì)的相互作用而形成的物理障礙。
非反義效應(yīng)使藥物工業(yè)進(jìn)退兩難，其不可預(yù)測性使得對核酸藥物的研究變得復(fù)雜起來。非反義效應(yīng)并非*有害，實際上它們的附加療效對藥物工業(yè)來說是大有益處的，某些非反義ODN已被用來作為佐劑提高免疫治療及疫苗的效能。非反義效應(yīng)的復(fù)合作用機(jī)制有可能生產(chǎn)出集許多復(fù)合療法為一身的單一藥物。對藥物來說，非反義效應(yīng)也有不利的一面，它給基因?qū)ひ捳邘砗艽蟮睦щy。在對其作用機(jī)制一無所知的情況下，把對藥物有益的非反義效應(yīng)作為研究制劑來考慮時往往成為不利因素，將其用于分子生物學(xué)的研究將會是災(zāi)難性的。由于對其作用機(jī)制缺乏了解，使反義藥物沒計起來非常困難，也很難形成商業(yè)化，而且它們還可能成為毒性的來源。
靶RNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其與細(xì)胞蛋白質(zhì)的相互作用使許多可能的結(jié)合部位不能與反義分子結(jié)合。當(dāng)核酸藥物通過Watson-Crick配對，與靶RNA的暴露區(qū)域互補且局限于此區(qū)域時，真正的反義效應(yīng)才能得到增強(qiáng)，而不需要的反義效應(yīng)才能降低，然而這種優(yōu)化是很耗時的。目前有效的核酸藥物必須在大批候選庫中，通過流水線式的篩選才能得到。
二、對臨床是否有益是檢驗核酸藥物的標(biāo)準(zhǔn)
沒有哪一種藥物具有*的選擇性，通常具有生物活性的化合物有許多種效應(yīng)，需要用劑量—效應(yīng)曲線來對化合物進(jìn)行初步的藥理鑒定。象對所有其它藥物進(jìn)行研究時所做的那們，只有了解其臨床用途，以及獲得了它的劑量—效應(yīng)曲線的定量信息和治療參數(shù)以后，才能判斷反義藥物的價值。
核酸藥物的治療作用需要經(jīng)過慎重的調(diào)節(jié)，與傳統(tǒng)藥物典型的2~3個幅度范圍的劑量—效應(yīng)曲線相比，反義藥物的曲線只局限在很窄的濃度范圍內(nèi)。無論在體外或在體內(nèi)，1/10的量就可將產(chǎn)生非反義效應(yīng)的濃度與產(chǎn)生*反義效應(yīng)的濃度分開。極陡的劑量—效應(yīng)曲線通常表明一個藥物有多種的協(xié)同作用機(jī)制。這些治療窗口很窄的藥物可能非常有效而且極有價值，但在應(yīng)用的安全性方面也較難處理。因為反義與非反義效應(yīng)的比率在限定的濃度范圍以外迅速下降，要獲得一致的治療結(jié)果是很有挑戰(zhàn)性的。
三、反義藥物實驗標(biāo)準(zhǔn)
反義藥物*的誘惑力和媒介宣傳總使得反義試劑涉及到的問題變得微乎其微。當(dāng)一個反義分子引起生物學(xué)效應(yīng)時，很難確定這一改變是因為該制劑特異地作用于靶RNA，這是由于一些非反義效應(yīng)（包括其它的楄苷酸和蛋白質(zhì)）在起作用。為區(qū)分反義和非反義效應(yīng)通常采用的策略是應(yīng)用一個與反義寡核苷酸順序相比已改變了的寡核苷酸，不幸的是，不是所有的非反義效應(yīng)都能檢測到。有些例子中采用的標(biāo)準(zhǔn)非常松，已發(fā)表的反義文章的性的評估只有50%~5%。這些調(diào)查結(jié)果強(qiáng)調(diào)制定更嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的必要性，而且應(yīng)用純的寡核苷酸制劑的必要性也得到強(qiáng)調(diào)。選擇性地發(fā)表一些理想（陽性）的結(jié)果逐漸受到了壓力。這表明我們在進(jìn)行反義研究時應(yīng)保持高度的警惕性，必須同時檢測較多的對照ODN，對每一個“反義”分子都需要經(jīng)過不厭其煩的驗證。
四、反義技術(shù)與單一基因性之間的距離
針對單一基因的能力對藥物來說是困難的。在研究領(lǐng)域中，特異性對一個有效的實驗制劑來說雖不是zui根本的，但確是一個關(guān)鍵的特性。隨著選擇性的剔除基因的手段逐漸得到改善并越來越容易操作的時候，從時間、經(jīng)費及選擇性等方面比較以后來考慮反義技術(shù)就顯得非常重要了。
不幸的是，對反義誘導(dǎo)的副作用的量化性數(shù)據(jù)所知有限，大部分信息來源于反義復(fù)合物的影響僅涉及少數(shù)分子的測量，如目標(biāo)靶RNA，持家基因和一些對照RNA。當(dāng)一個反義分子符合以下這兩種標(biāo)準(zhǔn)時，才能認(rèn)為是特異的：①細(xì)胞的生存力沒有大幅度的下降；②靶RNA與它所對應(yīng)的蛋白水平與對照RNA相比下降得多。不過這種類型的實驗在提供有關(guān)RNA和蛋白質(zhì)的總體水平改變時顯得很局限，它甚至不能給信號與全部的噪聲比提供一個粗略的估計。這種方法的另一個缺點是不能提供有關(guān)反義分子與其蛋白質(zhì)相互作用的直接信息，即使這種相互作用是反義分子產(chǎn)生效應(yīng)的主要動力。
到目前為止，反義分子能否選擇性擊中單一基因還不能被證實。隨著已測序的基因的增加，鑒定RNA是否有與反義分子互補的區(qū)域，以及評估反義療法對其它無關(guān)分子的作用都是可行的。此外，還可以通過篩查mRNA庫、cDNA差異展示技術(shù)或定量檢測基因表達(dá)圖譜的基因芯片雜交的方法來分析反義治療帶來的變化。如果這些方法可以檢測出未預(yù)料到的變化，可以應(yīng)用另一些技術(shù)將缺乏特異性的結(jié)果與反義反應(yīng)的下游結(jié)果區(qū)分開。有關(guān)意外擊中的數(shù)目以及其它基因表達(dá)的改變的相互作用本質(zhì)的信息可以指導(dǎo)將來的藥物開發(fā)。這種特異性，無論它到底是什么，一定會隨著現(xiàn)行的策略的優(yōu)化以及產(chǎn)生更少副作用衍生物的核酸化學(xué)的發(fā)展而大大提高。
五、特異性的理論局限性
雖然ODNs和核酶確定能擊中它們的靶部位，但到目前為止，尚無任何證據(jù)表明，反義藥物具有僅僅剔除一個基因的能力。理論給反義特異性提供了有用的數(shù)據(jù)。單倍體人類基因組有3×109個堿基。在這樣大的隨機(jī)順序中，17或大于17個核苷酸的任意順序僅出現(xiàn)一次的概率很高。為了剔除某一基因，必須將17個堿基正確匹配者從只有一個堿基錯配者中區(qū)別出來。
要想知道ODN的分辨力，就必須知道它們的作用機(jī)制，這種機(jī)制可能隨細(xì)胞類型的不同而不同，也可能依賴于靶RNA或ODN的特性。不過，在許多體系中，靶RNA都能因RNase h的作用而被消耗。RNase h的活性切割DNA-RNA雜交體中的RNA成分，它們并不需要長的雜交區(qū)作為底物，實際上，在體外RNase h切割的對象可以只有4個堿基對。對于標(biāo)準(zhǔn)的ODN來說，10個堿基對對人類也就足夠了；在經(jīng)化學(xué)修飾過的核苷酸中，少至7個堿基對就可被切割。對每一個10堿基核苷酸順序來講，在人類基因組中平均有3000個拷貝，因此，任何特異的10堿基出現(xiàn)在許多個RNA中的可能性是極大的。當(dāng)一個互補于這樣的一個10堿基的ODN被導(dǎo)入細(xì)胞時，所有含有這些10堿基的RNA都有被RNase h切割的風(fēng)險。當(dāng)然，并不是所有的3000個拷貝都會被切割，這是因為許多拷貝可能并不出現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄物中，而出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄物中的也會有許多是RNase h無法接近的。但是，即使是3000個拷貝中的1%被擊中的話，也會直接影響到30個基因。而且，有兩個原因使得“風(fēng)險”基因的數(shù)目數(shù)超過3000個；①典型的ODN平均含有20個或更多的堿基，每20個堿基含有11個10堿基，而每一個10堿基平均會出現(xiàn)3000次；②RNase h可能不需要10個連續(xù)的堿基對就能完成切割。因為RNase h只需要很小的雜交區(qū)，所以不能通過增加ODN長度來增加其特異性。實際上，由于會使錯配順序更穩(wěn)定的結(jié)合，大于zui小值的長度可能會有反作用。
在對非洲爪蟾卵母細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上，人們發(fā)現(xiàn)只想讓目的靶RNA被切割，而不同時發(fā)生至少是部分非靶RNA被切割的情況恐怕是不可能的。目的與非目的靶RNA被擊中的比率依賴于一些復(fù)雜的因素，這些因素決定了反義分子與靶目標(biāo)是否并存以及RNA內(nèi)的互補部位是否被掩蓋或是被分子鍵作用而使它們不可接近。將來，即使是反義化學(xué)的發(fā)展降低了ODN與蛋白質(zhì)的結(jié)合，由RNase h導(dǎo)致的對特異性的限制還將存在，在評價反義策略時必須牢記這一點。
核酶對靶部位識別也是由Watson-Crick法則決定的，因此，與ODN一樣，它也有類似的特異性方面的局限性。核酶通過識別不同長度的順序與靶RNA結(jié)合。一個與靶RNA能形成較多數(shù)目堿基互補的核酶，并不比那些識別相對較短順序的核酶具有更強(qiáng)的對目的靶RNA的分辨力。實際上，延長識別順長度反而會降低核酶的分辨力。目前正在研究是否存在這樣一種順序，既短到能分辨與靶RNA相差一個堿基的RNA而使其不被切開，又長到允許一個單一的RNA可以被選擇性的破壞。核酶能擊中單一基因這一情況并不讓人感到驚訝。大部分核酶都是槌頭或發(fā)夾狀分子，自然狀態(tài)下，可以共價地結(jié)合在其切割部位上，自身切割病原體亞病毒（類病毒）的前體分子。為了充分起作用，核酶從同樣小的RNA分子的有限數(shù)目的堿基中選擇其切割部位。因此，人工合成的核酶比自然形成的核酶有更高的特異性。當(dāng)然，象其它RNA一樣，核酶有與細(xì)胞蛋白結(jié)合的可能性，因此，會產(chǎn)生顯著的非反義生物學(xué)效應(yīng)。
當(dāng)考慮反義特異性的理論局限性時，需牢記基因組并不是一個“隨機(jī)的順序”。一個RNA中含有的“好”的反義靶順序在另一些RNA中出現(xiàn)的機(jī)率會比預(yù)測的更高或更低。應(yīng)用生物順序的趨勢可能會限制這種只依靠Watson-Crick互補法則的策略的特異性，隨著對人類基因順序完整數(shù)據(jù)的獲得，這種傾向性會得到更細(xì)致的分析。
六、反義介導(dǎo)的基因剔除原則
在細(xì)胞內(nèi)，不能通過體外經(jīng)常采用的諸如提高溫度，或改變離子強(qiáng)度以降低核苷酸雜交背景的策略來提高特異性。因此，需要一些其它的策略來提高細(xì)胞內(nèi)的特異性。有一種方法被用來設(shè)計多重反義復(fù)合物，復(fù)合物中的每一亞單位都直接作用于同一個靶RNA的不同部位，通過分子三角關(guān)系將其消滅。除此之外，還有一些工作解決了RNA分子中所有部位不同等暴露這一問題。如果與反義ODN互補的10堿基出現(xiàn)在靶RNA的可接近區(qū)，又在無關(guān)RNA的被保護(hù)區(qū)，靶RNA就會被優(yōu)先消耗掉。而鑒別互補于靶RNA脆性部位的反義分子是很難做到的，因為RNA是一種內(nèi)部結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜的分子。
zui近的研究強(qiáng)調(diào)了RNA內(nèi)結(jié)構(gòu)限制其與ODN結(jié)合的程度。人們發(fā)現(xiàn)能與mRNA穩(wěn)定結(jié)合的ODN極少，這些結(jié)果指出這種結(jié)合可能只發(fā)生在RNA可被接近的區(qū)域，靶RNA結(jié)構(gòu)是決定反義分子特異性的主要因素。象ODN一樣，核酶的靶部位的可接近的區(qū)域，靶RNA結(jié)構(gòu)是決定反義分子特異性的主要因素。象ODN一樣，核酶的靶部位的可接近性也有變化。細(xì)胞蛋白及核糖核酸蛋白復(fù)合物，如核糖體，會防礙核酶介導(dǎo)的切割作用，那種認(rèn)為“核酶擴(kuò)散，結(jié)合隨后切割非結(jié)構(gòu)RNA這種容易的過程似乎是過于簡單了”。因為預(yù)測在體內(nèi)RNA分子的哪一部分能被接近是很困難的，必須篩查大批候選者才能找出能在細(xì)胞內(nèi)起作用的反義分子。
七、設(shè)計反分子的策略
在任何時刻，RNA固有的結(jié)構(gòu)以及它們與蛋白質(zhì)的結(jié)合都限制了RNA分子中可接近部位的數(shù)目，因此為特異性提供了基礎(chǔ)。結(jié)合象一件稀有的例外事件，反義分子被排除在大多數(shù)互補部位之外。因為這種可接近性是無法預(yù)測的，合理的設(shè)計反義分子是不可能的。由于缺少設(shè)計法則，需要經(jīng)過更精細(xì)的耗時、耗資過程，從20~50個候選者中選出有效的反義分子。如果說對50個分子的檢測能找出好的候選者，對上千個復(fù)合物的檢測會找出更好的。但如何設(shè)計它們呢？它們的順序僅僅依靠于能與靶RNA形成線性的Watson-Crick互補呢？還是象自然存在的反義TNA一樣包含切割部位？又該如何看待非規(guī)范的堿基配對作用和象莖-套這樣的結(jié)構(gòu)呢？
有關(guān)體外情況下ODN結(jié)合的可接近性與在體內(nèi)ODN介導(dǎo)的反義抑制的脆弱性之間的關(guān)系正在進(jìn)行探討，而且也將成為未來研究的一個領(lǐng)域。還不清楚體外篩查技術(shù)是否同樣能鑒別出在體內(nèi)起作用的ODN。有許多可能的順序需要選擇，看起來體外研究并不總能預(yù)測在體內(nèi)時的有效性，還需要開發(fā)能應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)的更新的篩查技術(shù)。
八、結(jié)論
隨著許多非反義效應(yīng)的作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，以及與目標(biāo)靶RNA的大部分Watson-Crick結(jié)合部位不可接近這一特點，使zui初產(chǎn)生的關(guān)于ODN和核酶非常容易設(shè)計以及它們可以選擇性地作用于靶部位這類觀點受到了動搖。篩查大批的候選反義分子及核酶，以及對體內(nèi)效應(yīng)的精心觀察既費時又費錢，這增加了用它們作為遺傳探針的困難。雖然關(guān)于它們的特異性尚存疑問，還具有越來越多的證據(jù)表明反義分子作為一種藥物工具是有用的。而且，某些非反義效應(yīng)也是有治療價值的，值得進(jìn)一步探討。因為非反義效應(yīng)目前尚不能預(yù)測，合理的設(shè)計法則還不能應(yīng)用在非反義藥物的生產(chǎn)中，這種效應(yīng)還需要逐例的進(jìn)行探討。
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